有色眼光──光線與文蛤視覺之關係
組員：林芳緯、劉律岑、林翊丞
摘要
文蛤Meretrix lusoria為台灣常見的食用貝類，但並無觀察其視覺的文獻。我們觀察光線對文蛤的影響。發現文蛤開殼在白光下較無光環境具有顯著差異(p < 0.05)，且文蛤在綠光及藍光下的開殼情況也會有顯著差異。而遮住文蛤外套膜會使文蛤開殼數量趨勢產生顯著差異，且我們以複式顯微鏡觀察其切片，發現外套膜與出入水管上皆具有色素。於是我們推斷，文蛤具有感光能力，並能夠分辨光線，而在外套膜上的色素，即為其感光構造。
研究動機
文蛤是我們日常生活中經常可見的可食用貝類，網路上常常有一些報導敘述各種使文蛤伸出出水管吐沙的小撇步，其中也包含了許多關於光線促進或抑制文蛤吐沙的說法。但我們卻發現，從來沒有一本課本提及文蛤能夠感應光線，反而顯示文蛤等雙殼貝類沒有感光、視物的能力。然而最近的研究指出，同屬於雙殼貝類且與文蛤習性相似的扇貝擁有視覺，再加上學長姐們的確實驗出文蛤對不同光線有不同反應，因此我們決定重新設計實驗與器材，加強變因的控制，試圖找出光線具體對文蛤的影響，以及文蛤可能的感光部位。
研究目的
(一) 探討適合文蛤生長之環境與無沙飼養之方式。
(二) 探討文蛤是否有感光能力。
(三) 探討不同波段光線與文蛤伸出出水管之關係。
(四) 尋找文蛤感光器官可能存在的部位。
研究架構
研究方法
利用實驗，不同頻率光線照射文蛤，並計算其開殼數，經過統計，驗證：
(一) 文蛤是否具有感光能力
(二) 文蛤是否具有辨色能力
(三) 文蛤的感光構造
研究對象
文蛤，Meretrix lusoria為雙殼綱簾蛤目簾蛤科文蛤屬的一種軟體動物，外殼略呈三角形，腹緣鈍圓，外殼以黃褐色和深棕色為主(圖2-b)。能夠觀察到其伸出殼外的身體構造主要有足、出水管、入水管。出入水管為外套膜延伸出去的一部分(圖2-a)，自文蛤的長邊伸出，用以進行呼吸與攝食，其前端外緣可以觀察到有一深色環圈，頂端的纖毛也可以觀察到黑白相間的色素跡象(圖2-c)、(圖2-d)。
文蛤是一種濾食性動物，在自然環境下，會以釜足垂直潛入泥沙中，漲潮時，文蛤將出入水管伸出沙面，利用海水通過鰓小孔時進行呼吸與攝食。退潮後，文蛤才把出水管縮回殼內。其主要以微小的浮游或底棲矽藻為主要食物，也會攝食一些浮游植物，原生動物，無脊椎動物幼蟲以及有機碎屑等。
飼養環境架設
用海水素加自來水調製30‰海水（新竹海灘實測約為28-30‰），並加入水質穩定劑除去氯、氮以及其他重金屬物質，將水溫維持在攝氏18-23度。每次購買約100隻文蛤，分三組飼養於玻璃缸內，缸內架設濾水器與打氣幫浦。飼養初期，加入石英環與硝化菌，持續幾天後使硝化菌菌落於穩定生長，此時水中NH3/NH4+含量達穩定約0.25ppm以下。每兩天餵食浮游性藻類一次，並測量pH值與鹽度，穩定後pH值大約8.35。
實驗器材
暗室、毛玻璃、小臉盆（內層包裹黑色塑膠袋）、掌上型光譜儀Hi Point HR-360、LED燈（紅光637nm、黃光593nm、綠光531nm、藍光454nm、紫光413nm、白光），如下(圖3)、切片藥品（石蠟、酒精、二甲苯、蘇木精、伊紅）
實驗設計
每盆文蛤的海水鹽度固定為30‰，水量為盆高一半，完全沒過文蛤。實驗於暗室中進行，未開燈時照度為0，以紙板隔開不同顏色LED燈，確認光線互不影響，LED燈照度以掌上型光譜儀測量皆13 ± 2 lux，利用毛玻璃使光線均勻分散。
實驗步驟：
1. 文蛤隨機分成4盆，一盆15隻，搖晃至全部閉合後置於不同色光下。
2. 5分鐘為一單位，觀察20分鐘內，文蛤開殼的數量，開殼以文蛤伸出出水管為準。此為一次實驗。
3. 每次實驗間隔10分鐘，10分鐘後將每盆文蛤置於與前次不同的色光下。
4. 重複若干次，至一盆文蛤置於實驗所需之全部色光（實驗三為色光與套子的組合），此為一組實驗。4盆文蛤的數據整合後為一批實驗。
實驗一：光是否影響文蛤伸出出水管
1. 實驗目的：檢測文蛤是否對光線有反應，開殼數量與時間是否有關連。
2. 實驗色光：白光、無光
3. 數據分析：計算文蛤開殼數量與時間的相關係數r。以Paired t test雙尾檢定分析，驗證文蛤開殼在白光與無光下是否有差異。
實驗二：不同波段光線對文蛤的影響
1. 實驗目的：檢測文蛤是否能辨別不同波段光線(下以色光表示)。
2. 實驗色光：紅光、黃光、綠光、藍光、紫光、無光。
3. 數據分析：以ANOVA雙因數變異數重複試驗分析，驗證不同色光是否對文蛤開殼產生影響。由實驗一已得知，文蛤在有光環境下開殼數較多，故將五種色光分別與無光做Paired t test 右尾檢定，尋找對文蛤有影響的特定色光。
實驗三：以遮蔽方法確認感光位置
1. 前置實驗：遮蔽物對文蛤伸出出水管影響
(1) 實驗目的：確認黑色與透明套子是否會影響文蛤，對後續實驗造成誤判。
(2) 實驗色光：無光並以黑色套子遮蔽、無光並以透明套子遮蔽
(3) 套子製作：使被遮蔽處照度為0 lux的黑色不透光套子，以及作為對照組的透明套子。套子封口處套住文蛤開口端，將大部分外套膜擋住，僅留下出入水管可伸出來的一側，如(圖5-b)所示。
(4) 數據分析：Paired t test雙尾檢定分析無光下，不同遮蔽物對文蛤開殼數量影響。
2. 主要實驗：
(1) 實驗目的：測試文蛤外套膜是否能感知藍光。
(2) 實驗色光：藍光並以黑色套子遮蔽、藍光並以透明套子遮蔽
(3) 數據分析：Paired t test右尾檢定分析藍光下，遮蔽外套膜對文蛤開殼數量影響。
(五) 實驗四：顯微鏡與切片檢查
1. 實驗目的：觀察出入水管與外套膜的色素層。
2. 實驗步驟：
(1) 分別切下文蛤的出入水管(a)、黑色外套膜(b)、淺色外套膜邊緣(c)與淺色外套膜中央(d)(圖6)，置於複式顯微鏡下觀察並拍照。
(2) 切片：將上述組織泡酒精、二甲苯脫水並置換成石蠟。接著以石蠟包埋組織並切片(5μm)，將切出的蠟帶置於37℃載玻片上使其乾燥平整。一週後，用蘇木精與伊紅將標本染色，並用二甲苯固定，以封片膠封片並乾燥後，用複式顯微鏡觀察切片。
實驗結果
實驗一：光是否影響文蛤伸出出水管
每一時間文蛤在白光下的開殼數量皆大於在無光下，如(圖7)。且無光環境下開殼數量與時間之相關係數r=0.991，白光環境下r=0.924，得知文蛤開殼數量與時間呈高度正相關。故後續實驗中將不同時間分開討論。
實驗中，文蛤為隨機取樣，母體成常態分佈。將同批文蛤在不同色光下重複測驗，且不知白光下文蛤開殼數大於或小於無光下，因此採Paired t test雙尾檢定，比對不同光線下文蛤開殼均值是否有差異。
文蛤於白光下，開殼數量在10分鐘後相較無光環境達顯著差異水準(p < 0.05)。結合(圖7)可知，置於白光下10分鐘後，文蛤開殼數量較無光環境下顯著增加。
實驗二：不同波段光線對文蛤開殼的影響
因不同日期文蛤的活性條件不同，變異數大，故將不同日期分開討論。其中，六批數據以ANOVA雙因子變異數分析的時間(5、10、15、20分鐘)與色光的交互作用未達顯著差異水準(p > 0.05)，因此可以視時間與色光無交互作用，分開討論。
由實驗一已知文蛤在光線下開殼數量較多，故以下實驗均採右尾t test檢定，照藍光與綠光之文蛤開殼數皆顯著大於無光環境下之文蛤(p < 0.05)，如(表二)。推知文蛤可能較易感知綠光與藍光，可顯著增加文蛤的開殼數量，而其餘色光對文蛤則較無影響，因數據過多故未放上。
實驗三：以遮蔽方法確認感光位置
(1) 前置實驗：無光環境下黑色與透明套子照度皆為0，驗證套子差異對文蛤的影響。
由(圖8)與(表三)可知，相同時間下，黑色套子和透明套子的平均開殼數量幾乎相同，且p值遠遠>0.05，無顯著差異。因此推斷，黑色與透明兩種套子之間，對文蛤的開殼沒有造成差異，可以在以下實驗排除不同種套子可能造成的誤差。
(2) 主要實驗：取實驗一中，對文蛤有顯著影響的藍光實驗。
藍光下套透明套子的文蛤開殼數量顯著大於黑色套子 (p < 0.05)，如 (圖9)(表四)。由前置實驗結果排除不同遮蔽物差異，可將變因視為文蛤被遮蔽的部位。故推測，在被黑色套子遮蔽照度為0的外套膜組織上，有能讓文蛤感知藍光的構造。
(四) 實驗四：顯微鏡與切片檢查
1. 出入水管
由(圖10-a、b)可以看出入水管內外側皆有色素，但分佈方式不同，出入水管外側色素成點狀密集排列、內側則為分散的條狀且顏色較深，且在纖毛連接處有一條深色色素帶。(圖10-c、d)可看見纖毛上亦有色素分佈，放大後可清楚看見色素顆粒呈不規則形排列。將出入水管剖半後縱切，其外緣可見一列排列緊密整齊的長條狀深色含色素組織(圖10-e)，此為(圖10-a)深色的放大部分。
2. 黑色外套膜
由(圖11-a)可見黑色外套膜最外緣有一深色色素帶，即為我們肉眼所見外套膜黑色部分，色素集中分佈於此區域。且在觀察的文蛤中，每隻文蛤黑色外套膜的長度並不相同，有些僅在出入水管旁可見，有些延伸至文蛤的短邊。
而外套膜上亦有纖毛構造，但其形態、長度皆與出入水口的纖毛不同，且外套膜的纖毛上並沒有色素分佈，深色色素帶並未隨纖毛向外延伸(圖11-b)。放大後可看見黑色外套膜上的色素顆粒型態(圖11-c)與出入水管相似(圖10-d)。將其切片檢查後，可看見外套膜組織邊緣有深色且排列成條狀顆粒較長的組織，長度與出入水管上(圖10-e)相似但排列較鬆散(圖11-d、e)，推測為相似色素組織。
3. 淺色外套膜邊緣
文蛤的外套膜邊緣除了黑色部分，其餘皆是偏米黃色的淺色外套膜，有時可以看見由黑色外套膜延伸出的褐色線條(圖12-a)，將其放大後可看見與旁邊部分不同的褐色點狀分佈，推測可能亦為色素。切片後再放大，可見褐色部分為一明顯排列成條狀較緊密的深色組織，在分佈均勻的外套膜組織中央(圖c)。
4. 淺色外套膜中央
文蛤外套膜中央部分為米白色接近透明，平時皆包覆於外殼內，不會露出殼外。外套膜中央質地均勻，無特別紋路或顏色聚集(圖13-a、b)，推測因其不會接觸光線，故沒有色素的存在。切片後亦可見其組織分佈均勻(圖13-c)，且在前述其餘部分外套膜與出入水管的淺色部分，也可以見到大面積相似的組織，推測是外套膜主要構成組織。
結論
過去文獻中，幾乎沒有關於文蛤的視覺、感光能力的描述與研究，然而網路上關於光線可影響文蛤伸出出水管的說法卻眾說紛紜，因此我們設計實驗希望驗證上述說法是否正確。
探討文蛤的感光辨色能力及其原因
根據實驗一、二得知，文蛤在白光下的開殼數量大於無光環境，且僅藍光與綠光對文蛤開殼有顯著影響。故可以合理推斷文蛤能夠感測光線，並具有一定辨色能力。
文蛤多棲息於潮間帶和淺海的沙泥底，在漲潮時開殼伸出出入水管濾食，而退潮時則很可能離開水面。我們推論文蛤在自然環境中可能需要感光，以辨識白天夜晚避免危險及高溫日照。且文蛤對本次實驗採用的低照度(13 lux)光線有反應，因此推測夜間仍需判斷光線(正午日照可達5000lux以上，滿月約1 lux)。
而為何文蛤對藍光與綠光的反應較顯著呢？我們推測有兩個可能。其一，因不同色光在水中被吸收及散射程度不同，儘管在空氣中色光照度固定，然文蛤在水中所感受到的不同色光比例不同。Jerlov(1951)發現在清澈海水中，藍光(480-500nm)波段的穿透性最強；而在混濁水域中，則是綠黃(500-600nm)波段的穿透性較佳，此結果與實驗所得對文蛤有顯著影響的藍光(454nm)、綠光(531nm)相符。文蛤生長環境多為沙岸淺灘，海水混濁懸浮微粒多，可能以綠黃光穿透性最佳，導致文蛤對綠光敏感，而我們所使用的黃光(593nm)較接近橙色(590-620nm)因此可能對文蛤較無顯著影響。但單純考慮色光對海水穿透性仍以藍光最高，文蛤可能也因此對藍光有顯著反應。
其二，則可能是文蛤本身感光構造的性質，如特定種類的感光細胞、或感光細胞內不同基因表現出不同視蛋白導致。文蛤具有的這種視蛋白對藍光與綠光特別敏銳或許並不是巧合，因同為雙殼貝類的扇貝能見度曲線峰值同樣位於藍光與綠光的波段，Cronly-Dillon(1966)指出 "The photopic visibility curve displays two prominent peaks, one at approximately 480 mµ, and the other with wavelength maximum at approximately 540 mµ."我們推測這與文蛤、扇貝在水中生活並在夜間行動有關。
分析文蛤的感光構造
我們以前述實驗之結果繼續推廣，尋找文蛤的感光受器。根據實驗三，遮蔽文蛤外套膜時，其感光功能明顯受到影響。利用複式顯微鏡以及切片觀察文蛤的出入水管與外套膜，發現邊緣及表皮都有色素的存在。
文蛤的出入水管與外套膜是少數可以伸出殼外長時間接觸外界的部位，而我們僅在此部位有發現色素組織。從文獻資料得知，生物的感光構造通常與維生素 A 為基礎的視色素有關(馬冬梅，2013)，且Palmer(2017)指出，同為雙殼綱貝類，習性與生活環境與文蛤相似的扇貝，其感光受器位於外套膜上，可以經由凹面鏡反光到上方視網膜看見物體。因此經實驗驗證，我們推斷文蛤的感光構造位於外套膜與出入水管。而一份對文蛤外套膜的SEM檢查中提及，文蛤的外套膜與出水管上皆發現大量不均勻的色素顆粒，呈圓球形，且在上皮表面形成色素帶 (張安國，2011)。此結果與視蛋白之結構相仿。故我們推測文蛤的感光構造很有可能在外套膜的部分，但此推測仍需要更進一步的檢驗。
未來展望
我們希望未來有機會可以對文蛤外套膜與出入水管做更仔細的研究，如蛋白質純化，並以膠體電泳或層析法進行分析，並比文蛤外套膜上與出入水管上是否具有與軟體動物相同的視蛋白。或是進行色素分析，利用電子顯微鏡檢視外套模的冷凍切片等方法，希望可以找到其具體的感光受器與視覺構造。
參考資料
一、 Jerlov, N. G. (1951). Optical studies of ocean water. Rept. Swedish Deep-Sea Exped., 3, 1-59.
二、 Cronly-Dillon, J. R. (1966). Spectral sensitivity of the scallop Pecten maximus. Science, 151(3708), 345-346.
三、 馬冬梅、朱華平、桂建芳(2013)。動物眼睛的起源與進化研究進展。生物學雜誌，30(1)，64-67。
四、 Palmer, B. A., Taylor, G. J., Brumfeld, V., Gur, D., Shemesh, M., Elad, N., ... & Addadi, L. (2017). The image-forming mirror in the eye of the scallop. Science, 358(6367), 1172-1175.
五、 張安國、李太武、蘇秀榕、袁秀堂 (2011)。不同花紋文蛤外套膜的顯微及亞顯微結構的初步研究。水產科學，30(3)，132-135。